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      科學研究試劑

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      • P515-21.1.pdf

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        2021-05-07 13:49:04
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      2 × Phanta Max Master Mix

      2×Phanta?MaxMasterMix???最強模板兼容性的新一代高保真DNA聚合酶??超保真度?保真度是TaqDNAPolymerase的53倍,PfuDNAPolymerase的6倍每擴增300,000個堿基,錯配少于5個擴增更快?極限速度可達0.5sec/kb,30sec/kb可高效擴增絕大多數片段擴增更長質粒、λDNA等簡單模板有效擴增長度可達40kb,cDNA有效擴增長度可達10kb
      價格:
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      市場價
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      貨號:
      P515-01/02/03
      所屬分類
      高保真PCR
      數量:
      -
      +
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      269970
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      說明書

      2 × Phanta® Max Master Mix

      最強模板兼容性的新一代高保真DNA聚合酶

      超保真度:  保真度是 Taq DNA Polymerase 的 53 倍, Pfu DNA Polymerase 的 6 倍。每擴增 300,000 個堿基,錯配少于 5 個
             擴增更快:  極限速度可達 0.5 sec/kb,30 sec/kb 可高效擴增絕大多數片段
             擴增更長:  質粒、λ DNA 等簡單模板有效擴增長度可達 40 kb, cDNA 有效擴增長度可達 10 kb,基因組有效擴增長度可達 20 kb
             適應度廣:  適用于各種 GC 含量片段擴增,對 PCR 抑制劑具有超強的耐受度,可用于多種樣本的直接 PCR

      1.值得信賴的擴增保真度

      圖1

      2.優異的高GC 擴增能力

      以人基因組為模板擴增 654 bp、 900 bp、 800 bp、 1,200 bp、 1,400 bp、426 bp 目標片段,各擴增子 GC 含量均高于 68%。

      圖2

      3.穩定的粗品擴增能力

      圖3

      Phanta® Max 中添加了獨特的延伸因子、特異性促進因子以及平臺期解抑制因子,使其長片段擴增能力、擴增特異性以及擴增產量方面得到了大幅度提升。使用λDNA、質粒等簡單模板,Phanta® Max 可以有效擴增長達40 kb 的片段;使用基因組DNA等復雜模板,Phanta® Max 可以有效擴增長達20 kb 的片段;使用cDNA 模板,Phanta® Max 可以有效擴增長達10 kb 的片段。其擴增錯配率是普通Taq 聚合酶的1/53,是Pfu 聚合酶的1/6。此外,Phanta® Max 對PCR 抑制劑具有良好的抵抗能力,可用于細菌、真菌、植物組織、動物組織或全血樣品的直接PCR。Phanta® Max 中添加了在常溫下能夠抑制其5’ → 3’ 聚合酶活性和3’ → 5’ 外切酶活性的兩種單克隆抗體,可進行高特異性的熱啟動PCR。該酶具有5’ → 3’ 聚合酶活性和3’ → 5’ 外切酶活性,擴增產物為平端,適用于ClonExpress®和拓撲快速克隆試劑盒(C112/C113/C115/C601)。

      組分 P515-01 P515-02 P515-03
      2 × Phanta® Max Master Mix 1 ml 5 × 1 ml 15 × 1 ml

      -20°C保存

       

      關鍵詞:
      P515
      最強模板兼容性的新一代高保真DNA聚合酶
      最強模板兼容性的新一代高保真DNA聚合酶
      未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

      Q1:擴增效率低,實驗組無擴增條帶。

      A1:(1) 引物

      檢查人工合成的引物是否因存儲條件不當而降解;引物設計是否合理,可利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

      (2) 模板

      長期放置、反復凍融會導致模板斷裂、開環或降解,應使用新鮮制備的DNA雙鏈作為模板;模板GC含量過高會導致DNA的雙鏈無法打開,此時加入PCR Enhancer(貨號P021),可以有效降低解鏈溫度;模板的AT含量過高,可嘗試使用針對高AT的產品(貨號P501/P511);模板為粗品,存在抑制物,建議降低模板濃度(稀釋使用;若樣本為植物葉片,要確保植物為非多糖多酚植物,取新鮮幼嫩的葉片,并將葉片面積剪小,如黃槍頭尖部面積大?。?;若模板為cDNA,要確認逆轉錄所用RNA的純度及完整度。

      (3) 酶

      反應所用的酶因保存或運輸不當而失活,建議更換新酶或用另一來源的酶重新實驗。

      (4) 擴增體系

      反應體系配制錯誤,建議重復實驗。

      (5) 反應程序

      檢查變性溫度是否準確,PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符,如果溫度過高,酶在前幾個循環就迅速失活,溫度過低則模板變性不徹底;若模板為酵母菌,可將預變性時間延長10min;退火溫度不合適,可對退火溫度設置梯度,摸索最佳的退火溫度;如果目的片段較長,可嘗試Touch Down 程序;檢查延伸時間是否充足。

      (6) Mg2+濃度不合適

      Mg2+濃度過低可影響PCR產量甚至使PCR擴增失??;Mg2+濃度過高會降低PCR的特異性,應適當調整Mg2+濃度。

      Q2:擴增的條帶亮度不太亮。

      A2:(1) 引物

      檢查人工合成的引物是否因存儲條件不當而降解。

      (2) 模板

      首先確認模板的質量,長期放置、反復凍融會導致模板斷裂、開環或降解,應使用新鮮制備的DNA雙鏈作為模板;如果模板沒有了,可用首次擴增產物按倍比稀釋后作為模板進行二次擴增。

      (3) 酶

      可適當提高酶的使用量。

      (4) 反應程序

      可嘗試使用Touch Down程序;延長延伸時間,提高循環數。

      Q3:擴增特異性差,非特異性擴增。

      A3:(1) 引物

      引物設計不夠優化。引物與靶序列有非特異性互補或自身聚合成二聚體,可降低引物濃度進行優化,必要時重新設計引物。

      (2) 模板

      模板不純,被污染,需重新制備模板。

      模板降解或過量,通過電泳檢查模板完整性及濃度,必要時重新純化模板。模板的使用量請參考說明書。

      (3) 反應程序

      反應程序不夠優化。如果出現比目的條帶小的雜帶,可通過提高退火溫度,降低循環數調整;如果出現比目的條帶大的雜帶,可縮短延伸時間、降低循環數。

      (4) 酶

      酶量加入過多。高保真系列:50μl體系加1U。

      Q4:擴增產物跑膠條帶彌散或拖尾。

      A4:(1) 膠

      制膠時要使膠完全融化。

      (2) 引物

      檢查人工合成的引物是否因存儲條件不當而降解。

      (3) 模板

      模板降解或過量,可通過電泳檢查模板完整性及濃度,必要時重新制備模板。模板的使用量請參考說明書。如果目的條帶較長,模板是cDNA,要確認逆轉錄所用RNA的純度及完整度,逆轉錄時不加隨機引物重新逆轉錄。

      (4) 反應程序

      反應程序不夠優化。退火溫度不合適,可對退火溫度設置梯度,摸索最佳的退火溫度;嘗試Touch Down 程序。

      (5) 酶

      酶量加入過多。高保真系列:50μl體系加1U。

      Q5:空白對照出現擴增產物。

      A5:(1) 引物設計不合理

      擴增序列與非目的擴增序列有同源性,PCR也可以擴增出非靶序列的序列。

      (2) 若擴增產物條帶大小與目的條帶一致,說明有污染

      更換新的Mix、水或引物重復實驗。反應體系在超凈工作臺內配制,減少氣溶膠污染。

      (3) 為了避免靶序列受到整個基因組或大片段的交叉污染,操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。

      (4) 為了避免靶基因受到空氣中小片段核酸污染,可用巢式PCR方法減輕或消除污染。

      Q6:高保真酶擴增保真性差,存在突變。

      A6:高保真酶在PCR時擴增產物有突變,可以從以下幾點來分析:

      (1) 模板本身存在突變

      檢查模板,若模板是質粒,建議送質粒去測序;若模板是cDNA,建議重復實驗,如果仍有突變,可能是cDNA有問題,建議重新制備cDNA,制備cDNA前檢測RNA的完整度及純度。

      (2) 模板反復凍融

      重新制備模板。

      (3) 模板長時間在紫外光下照射,引入突變

      切膠回收過程中避免長時間在紫外光下照射。

      (4) 基因序列與NCBI上的不一致

      建議再重復一次送去測序,若結果和上一次一樣,說明序列可能和NCBI上的不一致。

      (5) 少量序列存在非嚴謹序列

      有相似重組序列,導致重組錯位。

      Q7:條帶大小與理論不符。

      A7:(1) 實驗體系污染

      建議使用全新的試劑和槍頭,對工作臺進行清潔。

      (2) 模板或引物使用錯誤

      建議更換模板和引物。

      (3) 存在基因亞型

      建議對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。

      Q8:擴增產物跑膠時加樣孔很亮,目的條帶很暗。

      A8:可能是循環數過多一些非特異性條帶、蛋白、目的條帶混合在一起形成大分子聚合物跑不下來??上騊CR產物中加入SDS,95℃加熱5min,再跑膠。也可擴大體系,多擴幾管,最后切膠一起回收。

      Q9:逆轉錄后的產物cDNA作為模板,使用P505,一次應該加多少體積?

      A9:說明書建議cDNA模板使用量為1-5μl(不超過PCR反應總體積的1/10),可在這個范圍內嘗試不同的使用量,摸索最佳使用量。

      Q10:高保真酶擴增完的產物是否帶A,若后面要做TA克隆該如何進行?

      A10:高保真酶擴增完的產物不帶A,可嘗試使用Vazyme無縫克隆產品C112/C113/C115;若后面做TA克隆可用普通的Taq酶進行加A反應。

      具體加A方法:在10μl體系中,加入純化后的PCR產物1-7μl,同時加入1μl 10×Taq Buffer(含MgCl2)、0.5μl 10mM dNTPs、0.2μl Taq DNA聚合酶(不加引物),最后用超純水補足體系,72℃反應10-15min即可。

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