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      Hyperactive In-Situ ChIP Library Prep Kit for Illumina(pA-Tn5)

      科學研究試劑

      高通量測序文庫構建試劑

      藥物研發試劑

      • TD901-TD902-說明書V9.2.pdf

        大?。?/span>
        2020-06-30 23:43:57
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      Hyperactive In-Situ ChIP Library Prep Kit for Illumina(pA-Tn5)

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      說明書

      Hyperactive® In-Situ ChIP Library Prep Kit for Illumina(pA-Tn5)

       

      操作簡單:可一步實現DNA的片段化和接頭連接,僅需9 h即可實現從細胞到二代測序文庫的轉化

      超高活性:兼具Protein A&Tn5活性,DNA片段化活性極高

      細胞起始量低:可兼容低至60個細胞,甚至單細胞

      純度高:蛋白純度高、核酸殘留低

      1. CUT&Tag技術原理及應用

      CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)是替換傳統的ChIP-Seq用以研究蛋白質-基因組互作的新技術,與后者相比,它具有顯著優勢,如:信噪比高,可重復性好,實驗周期短(1天實現從細胞到文庫構建),細胞投入量低等,尤其適用于早期胚胎發育、干細胞、腫瘤以及表觀遺傳學等研究領域。

      CUT&Tag技術的實驗流程簡單,主要包括:①收集細胞;②分別孵育一抗和二抗;③孵育pA/pG-Tn5轉座子(Hyperactive® pA/pG-Tn5 Transposon);④激活轉座子,進行DNA片段化;⑤DNA提??;⑥文庫擴增與純化。

      2. 轉座子活性高

      A:基因組DNA打斷效果

      如圖所示,分別使用Vazyme #TD902中提供的pA-Tn5轉座子與市售轉座子(來自N公司)進行活性檢測;投入50 ng人基因組DNA,各取1 μl轉座子進行DNA片段化(10 min),可以看出,Vazyme #TD902中的pA-Tn5融合酶切割DNA活性很高,文庫產量顯著高于N公司。

      B:活細胞CUT&Tag實驗 

      10,000 cells-Vazyme pA-Tn5

       10,000 cells-N

      如圖B所示,投入10,000個HEK293細胞,分別使用Vazyme #TD902中提供的pA-Tn5轉座子與市售轉座子(來自N公司),按照各自說明書推薦的反應體系進行CUT&Tag實驗;其中,pA-Tn5轉座子使用的終濃度為0.04 μM,N公司轉座子按照1:100進行稀釋,一抗為H3K27me3(CST,#9733),二抗為Goat anti Rabbit(Bioworld,#BS13271)。通過使用Agilent 2100 Bioanalyzer進行文庫分布檢測,結果顯示,Vazyme的pA-Tn5轉座子切割活性明顯高于N公司,可構建出與文獻報道類似Ladder狀CUT&Tag文庫。

      C: Peak 富集

      如圖C所示:將圖B中的CUT&Tag文庫進行二代測序分析,可以看出,使用Vazyme #TD902獲得的文庫信噪比顯著高于N公司的文庫。

      3. 實驗重復性好

      如上圖所示,投入不同起始量(1,000、10,000或100,000)的HEK293細胞,每種起始量做2個重復,按照Vazyme #TD902說明書推薦的反應體系進行CUT&Tag實驗;其中,pA-Tn5轉座子使用的終濃度為0.04 μM,一抗為H3K27me3(CST,#9733),二抗為Goat anti Rabbit(Bioworld,#BS13271),陰性對照為與一抗同源的IgG(CST,#2729)。對上述文庫樣本進行二代測序,針對富集的reads進行pearson相關性分析,可以看出,平行樣本之間的重復性較好。

      Hyperactive® In-Situ ChIP Library Prep Kit for Illumina是針對CUT&Tag技術定向開發的專用試劑盒。CUT&Tag技術是一種研究蛋白質-DNA互作的新方法,通過將Protein G或Protein A與經過工程學改造的超高活性Tn5轉座酶融合,形成兼具雙重活性的新型融合酶(Hyperactive® pG-Tn5/pA-Tn5 Transposase),在抗體引導下精準靶向切割目的蛋白附近的DNA序列。與傳統的ChIP-Seq相比,該技術具有細胞投入量低、實驗周期短、信噪比高、可重復性好等優勢,尤其適用于早期胚胎發育、干細胞、腫瘤以及表觀遺傳學等研究領域。試劑盒中所有試劑都經過嚴格的質量控制和功能驗證,最大程度上保證了文庫構建的穩定性和重復性。

      BOX 1:ConA beads 2 ~ 8℃保存,其余組分室溫儲存。

      BOX 2:5% Digitonin -30 ~ -15℃保存,室溫下可保存1周;

      10 × Binding Buffer -30 ~ -15℃保存,2 ~ 8℃下可保存6個月;

      其余組分-30 ~ -15℃儲存。

      未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

      Q1:CUT&Tag適用于什么物種?

      A1:CUT&Tag Protocol廣泛適用于常規哺乳動物細胞的蛋白-DNA互作研究,酵母、植物等細胞可以經過特殊的處理(破除細胞壁或者提取細胞核)來進行實驗,操作可以參照CUT&RUN技術的前端處理方式。

      Q2:ConA磁珠主要作用是什么?

      A2:ConA磁珠是采用刀豆蛋白A包被過的,能與細胞膜上的糖蛋白結合,從而吸附細胞,使細胞處理操作可視化,從而減少在后續實驗過程中的細胞的損失。

      Q3:TD901與TD902如何選擇?

      A3:TD901試劑盒提供的是Protein G與Tn5融合的轉座子,TD902提供的是Protein A與Tn5融合的轉座子,可以直接用于CUT&Tag實驗;針對大多數抗體,二者均具有廣泛的適用性,但是Protein A對兔來源抗體的親和力相對較高,Protein G對于小鼠等部分哺乳動物抗體的親和力較高,請根據抗體來源種屬與Protein A或者Protein G的親和能力進行選擇。

      Q4:CUT&Tag是不是只能用Illumina平臺測序?

      A4:TD901和TD902提供的轉座子是針對Illumina平臺定向設計的,如果需要使用其他測序平臺,可以使用Vazyme #S602和#S603,更換適配相應平臺的接頭和Index擴增引物即可。

       

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