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      VAHTS Universal Pro DNA Library Prep Kit for MGI

      科學研究試劑

      高通量測序文庫構建試劑

      藥物研發試劑

      • NDM608-說明書V20.1.pdf

        大?。?/span>
        2020-08-10 13:33:48
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      VAHTS Universal Pro DNA Library Prep Kit for MGI

      價格:
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      貨號:
      NDM608-01/02
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      產品詳情
      FAQ
      組分
      說明書

      VAHTS® Universal Pro DNA Library Prep Kit for MGI

      高效修復DNA損傷: 有效修復堿基損傷、切刻、缺口和3’端封閉等問題

      建庫效率高: 文庫轉化率和擴增產出雙提升

      模板兼容性廣: 兼容 gDNA,FFPE DNA,cfDNA,Amplicons 等樣本

      完美兼容不同質量樣本: DNA修復酶對不同DIN值的FFPE DNA均有極佳的表現

      建庫耗時短: 單個文庫構建最短僅需90min

      1.FFPE損傷類型以及Vazyme FFPE DNA修復混合液的修復能力

       

      FFPE樣本損傷類型

      是否可以被DNA修復酶混合液修復

      胞嘧啶脫氨成尿嘧啶

      切刻和缺口

      堿基氧化

      3’端封閉

      DNA片段化

      DNA-蛋白交聯

      2.DNA損傷后不修復和修復建庫示意圖

      3.以264 bp的PCR擴增產物為模板,參照ND608的建庫流程進行PCR-free文庫構建,并用Agilent 2100檢測文庫峰型。ND608高效修復堿基損傷后文庫的轉化率高達66%。

      Agilent 2100檢測DNA片段沒有連上接頭、單端連上接頭及雙端連上接頭的產物峰型圖

      “0”表示:DNA片段沒有連上接頭;“1”表示:DNA片段一端連上接頭;“2”表示:DNA片段兩端都連上接頭。

      VAHTS® Universal Pro DNA Library Prep Kit for MGI是包含FFPE DNA修復模塊的MGI高通量測序平臺文庫構建試劑盒,可將100 pg – 1 μg Input DNA轉換成華大平臺專用文庫。本試劑盒包含DNA損傷修復模塊,能夠有效修復福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)導致的DNA損傷,如胞嘧啶脫氨、切刻和缺口、堿基氧化、3’端封閉等,同時兼容普通DNA樣本,不影響正常DNA樣本文庫質量。通過對末端修復模塊、連接模塊和文庫擴增模塊的整體改進,使文庫轉化率和擴增文庫產出大幅提升,廣泛適用于多種樣本的文庫構建,且兼容靶向捕獲流程。試劑盒中提供的所有試劑都經過了嚴格的質量控制和功能驗證,最大程度上保證了文庫構建的穩定性和重復性。

      組分

      NDM608-01

      (24 rxn)

      NDM608-02

      (96 rxn)

      DNA Damage Repair Enzyme

      48 μl

      192 μl

      End Prep Buffer

      240 μl

      960 μl

      End Prep Enzyme

      120 μl

      480 μl

      Rapid Ligation Buffer 2

      600 μl

      4 × 600 μl

      Rapid DNA Ligase

      120 μl

      480 μl

      VAHTS HiFi Amplification Mix

      600 μl

      4 × 600 μl

      PCR Primer Mix for MGI

      120 μl

      480 μl

      Control DNA (264 bp,50 ng/μl)

      10 μl

      10 μl

      -30 ~ -15℃保存。

      未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

      Q1:關于Input DNAFragmentation

      A1:a).試劑盒兼容的Input DNA量范圍為100 pg - 1 μg。應盡可能使用A260/A280 = 1.8 - 2.0的高質量Input DNA。Table 1中列舉了常見應用中推薦的Input DNA量。

      Table 1. 常見應用中推薦Input DNA量

      應用 樣本類型 推薦Input DNA量
      全基因組測序 復雜基因組 50 ng - 1 μg
      靶向捕獲測序 復雜基因組 10 ng - 1 μg
      全基因組/靶向捕獲測序 FFPE DNA ≥ 50 ng
      全基因組/靶向捕獲測序 cfDNA/ctDNA ≥ 100 pg
      全基因組測序 微生物基因組 1 ng - 1 μg 
      全基因組測序(PCR-Free文庫)  復雜/簡單基因組 ≥ 100 ng (不進行長度分選)
      ≥ 200 ng (進行長度分選)
      免疫共沉淀測序 ChIP DNA ≥ 100 pg

      上表為使用高質量DNA時推薦的Input DNA量,當Input DNA質量較差時,應適當上調使用量。

      b). Input DNA特指投入DNA Damage Repair & End Preparation步驟中的DNA。如DNA樣品在Fragmentation后進行過純化或長度分選,需再次測定其濃度,不能直接以Fragmentation之前的DNA量作為Input DNA量。否則,可能會因文庫擴增循環數不足導致文庫產出偏低。

      c).如之后進行文庫長度分選,推薦洗脫體積為105 μl;否則,推薦洗脫體積為22.5 μl。若Input DNA制備過程中帶入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽,可能會影響DNA Damage Repair & End Preparation步驟的效率。當使用機械法進行Fragmentation且產物不進行純化或長度分選直接建庫時,請將DNA稀釋在0.1 × TE中進行Fragmentation,請勿在滅菌超純水中進行;當使用酶切法進行Fragmentation且產物不進行純化或長度分選直接建庫時,請確認Stop Buffer中不包含過量的金屬離子螯合劑。如條件不滿足,可先將Fragmentation產物純化或長度分選后溶于0.1 × TE或滅菌超純水中(≤ 48 μl),再進行文庫構建。

      Q2:關于DNA Adapter

      A2:a).針對MGI測序平臺,Vazyme提供一套共96種Indexed Adapters。

      #NM108為單端10bp Indexed Adapters,共96種。

      b).DNA Adapter的質量和用量直接影響建庫效率和文庫的質量。Adapter投入量過高可能會導致Adapter 或Adapter Dimer殘留;投入量不足又會影響連接效率進而導致文庫產出降低Table 2列舉了不同Input DNA量推薦的Adapter使用量。

      Table 2 100 pg - 1 μg Input DNA推薦的Adapter使用濃度

      Input DNA Adapter:Input
      DNA
      摩爾比
      其他來源Adapter
      工作濃度
      Vazyme Adapter
      預稀釋倍數
      500 ng - 1 μg 10:1 - 20:1 510 μM 不稀釋
      100 ng - 500 ng 20:1 - 100:1 10 μM 不稀釋
      25 ng - 100 ng 50:1 - 200:1 5 μM 1:2
      5 ng - 25 ng 40:1 - 200:1 1 μM 1:10
      100 pg - 5 ng 60:1 - 3000:1 0.1-0.2 μM 1:30-1:200

      uInput DNA摩爾數可根據下述公式粗略計算:

      Input DNA摩爾數(pmol) ≈ Input DNA質量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度(bp)]

      u推薦根據表中的濃度值或Vazyme Adapter的稀釋倍數使用0.1 × TE預先稀釋Adapter,這樣可以保證建庫過程中Adapter的使用體積為固定數值(5 μl),避免加樣體積錯誤。

      uAdapter的質量會直接影響Adapter與Input DNA的摩爾比,進而影響連接效率和文庫產出。應選用優質的Adapter;使用0.1 × TE稀釋和保存Adapter溶液;盡量避免反復凍融。

      u提高Adapter的使用量可以在一定程度上提高文庫產出,尤其當Input DNA ≤ 25 ng時。當需要優化建庫效率時,可在上表推薦條件下額外嘗試幾個更高的Adapter使用量(推薦2 - 10倍范圍內)。如Adapter液濃度限制無法提高使用量,可通過提高Adapter使用體積來嘗試。如:默認Adapter使用體積為5 μl,

      u當Input DNA為500 ng - 1 μg時可提高Vazyme Adapter使用量至10 μl以增加5 - 15%的文庫產出。但是需注意提高接頭濃度可能會增加文庫中接頭殘留,造成測序數據浪費

      Q3:關于Adapter Ligation產物純化

      A3:a). Adapter Ligation產物需先去除過剩的Adapter,再進行后續文庫擴增。默認純化條件0.6 × (產物100 μl,磁珠60 μl)適用于絕大多數情況。如需獲得Insert Size更長的文庫,可通過適當降低磁珠使用量以減少小片段文庫的含量,但這種調整只能粗略改變文庫主峰的位置,如需要準確控制文庫長度分布,可在此步純化之后進行長度分選

      b).如之后進行文庫長度分選,推薦洗脫體積為105 μl;否則,推薦洗脫體積為22.5 μl。

      c). 如數據顯示純化產物中Adapter或Adapter Dimer污染嚴重,可對其再進行一次磁珠純化:使用滅菌超純水將第一次純化產物體積補至50 μl,加入50 μl磁珠(1 ×)進行第二次純化。這樣可以顯著降低Adapter或Adapter Dimer的殘留水平

      Q4:關于磁珠的使用

      A4:a). 試劑盒推薦使用VAHTSTM DNA Clean Beads (Vazyme #N411)進行磁珠純化。

      注意:如使用其他來源磁珠,純化條件可能需要更改!

      b). 磁珠操作通用注意事項:

      u磁珠使用量常用乘數“ × ”進行標識,表示相對于原始樣品體積而言使用多少倍體積的磁珠。如樣品原始體積為100 μl ,1 ×純化時磁珠使用體積為1 × 100 μl = 100 μl;0.6 × / 0.2 ×分選時第一輪磁珠用量為0.6 × 100 μl = 60 μl ,第二輪磁珠用量0.2 × 100 μ= 20 μl。

      u磁珠使用量直接影響可純化的DNA長度下限。乘數越高,可純化的DNA長度下限越短;反之,則越長。例如:1 ×磁珠只能高效純化長于250 bp的DNA,更短的DNA會在純化過程中大量丟失;提高至1.8 ×后,150 bp的DNA也可進行高效純化。

      u磁珠使用前應先平衡至室溫(室溫放置30 min),否則會導致得率下降、分選效果不佳。磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

      u樣品與磁珠充分混勻后置于磁力架上進行分離時,請于溶液徹底澄清后再吸取上清,吸取上清時應余留2 - 3 μl。若不慎吸到磁珠,會造成得率下降、分選效果不佳甚至影響后續酶反應。此時可將磁珠混勻重新置于磁力架上再次分離即可。由于磁力架吸力不同等原因,默認分離時間有時可能需要延長,以徹底分離磁珠和液體。

      u磁珠漂洗應使用新鮮配制并平衡至室溫的80%乙醇。漂洗過程中EP管應始終置于磁力架中,請勿擾動磁珠

      u產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續反應;過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下,室溫干燥5 - 10 min足以讓磁珠充分干燥,請勿加熱干燥(如置于37℃烘箱干燥)。

      u通常情況下,推薦使用洗脫液(10 mM Tris-HCl,pH 8.0 - 8.5)進行產物洗脫,這樣更有利于產物的穩定保存。然而,當后續需對文庫進行靶向捕獲時,為了利于捕獲前文庫干燥濃縮且避免對后續捕獲反應產生影響,應使用滅菌超純水進行產物洗脫。

      u洗脫產物可于4℃穩定保存一周;長期保存時應置于-20℃,避免不必要的反復凍融。

      Q5:關于長度分選

      A5:a).如Input DNA分布范圍較寬,建庫過程中通常需要進行長度分選以控制最終文庫長度分布范圍。推薦使用雙輪磁珠分選方案,也可通過切膠純化的方式進行分選。

      b).長度分選執行位置有多種選擇,可置于End Preparation之前、Adapter Ligation之后或Library Amplification之后。標準實驗方案中不包含長度分選步驟。如需進行,請參考附一、雙輪磁珠分選進行長度分選,DNA損失量約為60%-95%。有時需要在文庫長度分布(進行長度分選)和文庫復雜度(不進行長度分選)之間進行選擇。當Input DNA量較低時,應保證長度分選執行位置的唯一性,進行兩次或者兩次以上的長度分選會導致文庫復雜度和產出嚴重下降!

      c).過度擴增的文庫進行長度分布檢測時,常見高分子量位置出現拖帶或尾峰。對應產物多為非互補鏈交叉退火產物(參考06-6/關于Library Amplification)。推薦解決方案為調整擴增循環數,避免過度擴增,不建議通過長度分選去除拖帶或尾峰。

      d).Rapid Ligation Buffer 2中包含的高濃度PEG會對雙輪磁珠分選和切膠純化產生顯著影響。因此,如在Adapter Ligation之后進行長度分選,Adapter Ligation產物純化步驟(08/標準方案/步驟二/6.使VAHTS DNA Clean Beads對反應產物進行純化)不可省略,將純化產物洗脫至合適體積的洗脫液中,再進行雙輪磁珠分選或切膠純化;如確需在Adapter Ligation之后分選,分選條件需另行摸索。如在End Preparation之前或Library Amplification之前進行長度分選,可將原處純化步驟直接替換為雙輪磁珠分選或切膠純化。

      Q6:關于Library Amplification

      A6:a). PCR Primer Mix適用于擴增含完整長度Adapter的MGI高通量測序平臺文庫。推薦每條引物的擴增終濃度為5 - 20 μM。

      b).PCR反應后期,引物通常會先于dNTP被耗盡。此時,過多的循環會造成擴增產物解鏈后進行非特異性退火,產生非互補鏈交叉退火產物。這些產物在依賴電泳的檢測方式中遷移速率比較慢,在高分子量區域呈現彌散分布。它們是由正確長度的單鏈文庫構成,在變性后能夠與Flow Cell正常結合并被測序。因此,其存在與否對測序而言并無顯著影響。然而,這種產物的存在對于文庫定量方式的選擇會產生決定性影響。因產物不是完整的雙鏈結構,當使用基于識別雙鏈DNA的熒光染料(Equalbit dsDNA HS Assay Kit, Vazyme #EQ111等)來進行文庫定量時,定量結果會比實際值偏低;但基于qPCR的文庫定量體系(如VAHTSTM Library Quantification Kit for MGI,Vazyme #NQM101 - NQM106)在定量過程中包含變性過程,仍然可以準確定量這種過度擴增的文庫。

      c). Library Amplification步驟需要嚴格控制擴增循環數。循環數不足,會導致文庫產出不足;循環數過多,又會導致過度擴增、偏好性增加、重復度增加、嵌合產物增加、擴增突變積累等多種不良后果。Table 3列舉了當使用100 pg - 1 μg高質量Input DNA時,獲得100 ng或1 μg文庫推薦的擴增循環數。

      Table 3. 100 pg - 1 μg Input DNA擴增循環數推薦表

      Input DNA
      (Into End Preparation)
      Number of cycles required to generate
      100 ng
      Number of cycles required to generate
      1 μg
      100 pg 13 - 16 16 - 19
      1 ng 9 - 11 12 - 15
      5 ng 6 - 9 9 - 13
      10 ng 5 - 8 8 - 12
      50 ng 3 - 4 6 - 9
      100 ng 2 - 3 6 - 9
      50 ng 3 - 4 6 - 9
      100 ng 2 - 3 5 - 8
      250 ng 1 - 2 3 - 6
      500 ng 0 2 - 5
      1 μg 0 1 - 3

      u上表為使用約200 bp高質量Input DNA時測得的循環數參數。FFPE DNA質量差異較大,當DNA質量較差或文庫長度較長時,需適當提高循環數以獲取足量文庫。

      u若連接接頭后進行長度分選,則參照較高循環數進行Library Amplification;否則,參照較低循環數即可。

      d).當Adapter Ligation步驟中使用非完整長度Adapter時,須至少擴增2個循環以補全文庫末端Adapter序列。

      Q7:關于文庫的質量控制

      通常情況下,構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。

      A7:a). 文庫長度分布檢測:文庫長度分布可通過LabChip® GX、GXII、GX Touch (PerkinElmer);Bioanalyzer、Tapestation (Agilent Technologies);Fragment Analyzer™ (Advanced Analytical)等基于電泳分離原理的設備進行檢測。VAHTS® Universal Pro DNA Library Prep Kit for MGI建庫過程中各步驟產物的長度分布檢測如下圖所示。

      b). 文庫濃度檢測:

      常用文庫濃度檢測方法有兩種:基于雙鏈DNA熒光染料的方法,如Equalbit dsDNA HS Assay Kit (Vazyme #EQ111)、Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR絕對定量的方法,如VAHTSTM Library Quantification Kit for MGI (Vazyme #NQM101 - NQM106)。雖然前者簡單易行,但由于下述原因,推薦使用基于qPCR絕對定量的方法進行文庫濃度測定。

      當使用完整長度Adapter,且完成Adapter Ligation步驟之后,任何一個步驟產物都可以使用基于qPCR絕對定量的方法進行濃度測定??梢悦鞔_監控接頭連接、磁珠純化/分選、Library Amplification各步驟效率,進而能為體系優化和建庫異常原因分析提供依據。

      過度擴增的文庫因包含大量不完整雙鏈結構,不能使用Equalbit® dsDNA HS Assay Kit等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法。但基于qPCR絕對定量的方法不受過度擴增影響(參考06-6/關于Library Amplification)。

      Q8.其他注意事項

      A8:a). 使用前請將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻,短暫離心后置于冰上待用。

      b).配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打混勻,劇烈振蕩可能會造成文庫產出下降。

      c).為避免樣品交叉污染,推薦使用帶濾芯的槍頭,吸取不同樣品時請更換槍頭。

      d).推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應,使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

      e).PCR產物因操作不當極容易產生氣溶膠污染,進而影響實驗結果準確性。因此,我們推薦將PCR反應體系配制區和PCR產物純化檢測區進行強制性的物理隔離;使用專用的移液器等設備;并定時對各實驗區域進行清潔(使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理),以保證實驗環境的潔凈度。

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