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      科學研究試劑

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      • C112-說明書.pdf

        大?。?/span>
        2020-12-23 10:10:37
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      ClonExpress II One Step Cloning Kit

      ClonExpress?IIOneStepCloningKit??非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒??簡單、快速、高效,適用于任何載體無需考慮插入片段攜帶的酶切位點可高效克隆50bp-10kb的DNA片段線性化克隆載體和PCR產物可不純化直接克隆無連接酶,無自連,陽性率>95%??克隆效率極高???????圖1.重組產物轉化后平板上一般可形成數千個單克隆,而無插入片段的陰性對照反應轉化后只有數個
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      貨號:
      C112-01/02
      所屬分類
      快速克隆
      數量:
      -
      +
      庫存:
      39991
      暫時無貨
      1
      產品詳情
      FAQ
      組分
      說明書

      ClonExpress®II One Step Cloning Kit 

      非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒

      • 簡單、快速、高效,適用于任何載體

      • 無需考慮插入片段攜帶的酶切位點

      • 可高效克隆 50 bp-10 kb 的 DNA 片段

      • 線性化克隆載體和 PCR 產物可不純化直接克隆

      • 無連接酶,無自連,陽性率 >95%

      • 提供在線引物設計軟件CE Design

      1.克隆效率極高

      1

      重組產物轉化后平板上一般可形成數千個單克隆,而無插入片段的陰性對照反應轉化后只有數個單克隆形成。因此ClonExpress®系統的自連背景會大大降低連接酶依賴的克隆方式。

      2.克隆陽性率95%以上

      圖2 

      鑒定酶切結果表明,克隆陽性率可達95%以上。

      ClonExpress®技術是一種簡單、快速并且高效的 DNA 無縫克隆技術,可將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點。 ClonExpress®II 是新一代重組克隆試劑盒,包含增強的重組酶 Exnase®II。使用任意方式將載體進行線性化;在插入片段正 / 反向 PCR 引物 5’ 端引入線性化載體的末端序列,使得 PCR 產物 5’ 和 3’ 最末端分別帶有和線性化載體兩末端一致的序列 (15 bp-20 bp)。這種兩端帶有載體末端序列的 PCR 產物和線性化載體按一定比例混合后,在Exnase®II 重組酶的催化下,僅需反應 30 min 即可進行轉化,完成定向克隆,陽性率可達 95% 以上。

      組分

      C112-01 (25 rxn)

      C112-02 (50 rxn)

      5 × CE II Buffer

      100 μl

      200 μl

      Exnase®II

      50 μl

      100 μl

      500 bp control insert (20 ng/μl)

      5 μl

      5 μl

      pUC19 control vector,linearized (50 ng/μl,Amp+)

      5 μl

      5 μl

      - 30℃~-15℃保存

      關鍵詞:
      C112-01/02
      非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒
      未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

      Q1:引物如何設計?

      A1:(1) 引物設計:官網引物設計軟件CE Design V1.04,選擇相應模塊進行設計;

      (2) 載體的線性化方式有三種:雙酶切、單酶切和反向PCR,優先選擇雙酶切;

      (3) 引物由三部分組成:同源臂(15-20 bp,不計算酶切位點和殘留堿基,GC含量40%-60%)+酶切位點(根據實驗需求保留或舍棄)+特異性引物(引物Tm值的計算不包括同源臂的序列)。

      Q2:平板上長不出克隆或者克隆數很少。

      A2:(1) 引物設計不正確:引物包含15-20 bp同源臂(不計算酶切位點),GC含量40%-60%;若同源臂的GC含量過高或過低,可重新選擇插入位點;

      (2) 線性化克隆載體和插入片段擴增產物的使用量不足/過量,即比例不佳:盡量按照說明書推薦的量和比例配置重組體系;

      (3) 重組體系不低于10 μl,各組分添加不低于1μl(避免低體積添加造成量取不準);若載體或片段濃度過低導致添加量超過20 μl,可同比例降低載體和片段的添加量;插入片段長于載體時,重組體系中片段與載體的摩爾比為2:1;

      (4) 載體和插入片段不純,抑制反應:未純化DNA不應超過4 μl(反應體系體積的1/5);建議線性化載體和PCR產物進行膠回收純化,純化產物溶解在pH 8.0的ddH2O保存;

      (5) 感受態細胞的轉化效率需大于107 cfu/μg,重組產物的轉化體積不應超過感受態細胞體積的1/10,否則會降低轉化效率;選擇克隆用感受態細胞(如DH5α/XL10),不能選擇表達用感受態細胞;

      (6) 酶切獲得的載體應經加熱處理失活限制性內切酶,對于加熱處理不能失活的酶切體系,必須經過膠回收純化;

      (7) 核查基因是否致死。

      Q3:多數克隆含有不正確的插入片段。

      A3:PCR產物混有非特異性產物:優化PCR體系,提高特異性;膠回收PCR產物;鑒定更多的克隆。

      Q4:插入片段出現堿基突變。

      A4:插入片段在PCR獲得時使用高保真的聚合酶;若突變發生在同源臂區域,請進行引物序列核對。

      Q5:多數克隆不含插入片段。

      A5:(1) 克隆載體線性化不完全:可通過陰性對照檢測載體是否線性化完全;對于優化酶切體系,提高限制性內切酶使用量、延長酶切反應時間、膠回收純化酶切產物;

      (2) 插入片段獲得的PCR體系中混入了相同抗性的質粒:PCR擴增模板為環狀質粒時,如擴增產物直接用于重組反應時需進行DpnI消化,或者進行膠回收純化。

      Q6:陽性對照不長斑或很少。

      A6:(1) 平板抗性使用錯誤:試劑盒中提供的對照載體的抗性為A+抗性;

      (2) 感受態細胞效率低:確保轉化效率>107cfu/μg,可進行簡單檢測,將1 ng質粒轉化至100 μl感受態細胞中,取1/10進行涂板,生長1000個菌斑,估算感受態轉化效率為107cfu/μg;重組產物的轉化體積不應超過感受態細胞體積的1/10,否則會降低轉化效率;感受態選擇克隆感受態(如DH5α/XL10),不能用表達感受態。

      Q7:菌液PCR無條帶。

      A7:(1) 引物不正確:建議使用載體的通用引物進行菌檢,或至少使用一條通用引物;

      (2) PCR體系或程序不合適:沒有目的條帶也沒有空質粒條帶,建議優化PCR體系、程序;或者提取質粒,以質粒做模板PCR驗證,或著進行酶切驗證;

      (3) 重組失?。褐挥锌召|粒的條帶,說明重組不成功,載體線性化不完全,建議優化酶切體系。

      Q8:菌種(表達用)保存一段時間后出現表達量下降。

      A8:菌種在保存過程中,可能會出現質粒丟失,拷貝數降低的情況,重新培養時適當增加抗生素的濃度,篩選出含高拷貝數質粒的細菌。

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