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      ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit

      科學研究試劑

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      藥物研發試劑

      • cp

        ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit-V9.1.pdf

        大?。?/span>
        2020-12-23 10:20:26
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      ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit

      ClonExpress?MultiSOneStepCloningKit?非連接酶依賴型的多片段一步克隆技術可在幾乎任何載體的任意位點進行多片段拼接克隆????無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點????可一次實現二至五個插入片段的順序拼接????線性化克隆載體和PCR產物可不進行純化直接克隆酶切鑒定,克隆陽性率達到95%以上ClonExpress??MultiS是針對多片段克隆開發,試劑盒中包含專門
      價格:
      520.0
      市場價
      0.0
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      貨號:
      C113-01/02
      所屬分類
      快速克隆
      數量:
      -
      +
      庫存:
      39995
      暫時無貨
      1
      產品詳情
      FAQ
      組分
      說明書

      ClonExpress® MultiS One Step Cloning Kit 

      非連接酶依賴型的多片段一步克隆技術

      • 可在幾乎任何載體的任意位點進行多片段拼接克隆

      • 無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點

      • 可一次實現二至五個插入片段的順序拼接

      • 線性化克隆載體和 PCR 產物可不進行純化直接克隆

      • 提供在線引物設計軟件CE Design

      ClonExpress® MultiS是針對多片段克隆開發,試劑盒中包含專門針對多片段重組優化的buffer和重組酶Exnase® MultiS。首先將載體進行線性化,并在插入片段PCR引物5'-端引入線性化載體的末端序列;之后將這種兩端帶有載體末端序列的PCR產物和線性化載體按一定比例混合后,在Exnase®的催化下,僅需反應30 min即可進行轉化,完成定向克隆,陽性率可達95%以上。使用本試劑盒,可以將多至五個片段一次性順序拼接,極大簡化了實驗步驟。

      組分

      C113-01(10 rxn)

      C113-02(25 rxn)

      5 × CE MultiS Buffer

      40 μl

      100 μl

      Exnase®MultiS

      20 μl

      50 μl

      pUC19 control vector,linearized (50 ng/μl)

      5 μl

      5 μl

      Control insert Mix*

      5 μl

      5 μl

      * 0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl

       

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      關鍵詞:
      ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit
      C113-01/02
      未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

      Q1:引物如何設計?

      A1:(1) 引物設計:官網引物設計軟件CE Design V1.04,選擇相應模塊進行設計;

      (2) 載體的線性化方式有三種:雙酶切、單酶切和反向PCR,優先選擇雙酶切;

      (3) 引物由三部分組成:同源臂(15-20 bp,不計算酶切位點和殘留堿基,GC含量40%-60%)+酶切位點(根據實驗需求保留或舍棄)+特異性引物(引物Tm值的計算不包括同源臂的序列)。

      Q2:平板上長不出克隆或者克隆數很少。

      A2:(1) 引物設計不正確:引物包含15-20 bp同源臂(不計算酶切位點),GC含量40%-60%;若同源臂的GC含量過高或過低,可重新選擇插入位點;

      (2) 線性化克隆載體和插入片段擴增產物的使用量不足/過量,即比例不佳:盡量按照說明書推薦的量和比例配置重組體系;

      (3) 重組體系不低于10 μl,各組分添加不低于1μl(避免低體積添加造成量取不準);若載體或片段濃度過低導致添加量超過20 μl,可同比例降低載體和片段的添加量;插入片段長于載體時,重組體系中片段與載體的摩爾比為2:1;

      (4) 載體和插入片段不純,抑制反應:未純化DNA不應超過4 μl(反應體系體積的1/5);建議線性化載體和PCR產物進行膠回收純化,純化產物溶解在pH 8.0的ddH2O保存;

      (5) 感受態細胞的轉化效率需大于107 cfu/μg,重組產物的轉化體積不應超過感受態細胞體積的1/10,否則會降低轉化效率;選擇克隆用感受態細胞(如DH5α/XL10),不能選擇表達用感受態細胞;

      (6) 酶切獲得的載體應經加熱處理失活限制性內切酶,對于加熱處理不能失活的酶切體系,必須經過膠回收純化;

      (7) 核查基因是否致死。

      Q3:多數克隆含有不正確的插入片段。

      A3:PCR產物混有非特異性產物:優化PCR體系,提高特異性;膠回收PCR產物;鑒定更多的克隆。

      Q4:插入片段出現堿基突變。

      A4:插入片段在PCR獲得時使用高保真的聚合酶;若突變發生在同源臂區域,請進行引物序列核對。

      Q5:多數克隆不含插入片段。

      A5:(1) 克隆載體線性化不完全:可通過陰性對照檢測載體是否線性化完全;對于優化酶切體系,提高限制性內切酶使用量、延長酶切反應時間、膠回收純化酶切產物;

      (2) 插入片段獲得的PCR體系中混入了相同抗性的質粒:PCR擴增模板為環狀質粒時,如擴增產物直接用于重組反應時需進行DpnI消化,或者進行膠回收純化。

      Q6:陽性對照不長斑或很少。

      A6:(1) 平板抗性使用錯誤:試劑盒中提供的對照載體的抗性為A+抗性;

      (2) 感受態細胞效率低:確保轉化效率>107cfu/μg,可進行簡單檢測,將1 ng質粒轉化至100 μl感受態細胞中,取1/10進行涂板,生長1000個菌斑,估算感受態轉化效率為107cfu/μg;重組產物的轉化體積不應超過感受態細胞體積的1/10,否則會降低轉化效率;感受態選擇克隆感受態(如DH5α/XL10),不能用表達感受態。

      Q7:菌液PCR無條帶。

      A7:(1) 引物不正確:建議使用載體的通用引物進行菌檢,或至少使用一條通用引物;

      (2) PCR體系或程序不合適:沒有目的條帶也沒有空質粒條帶,建議優化PCR體系、程序;或者提取質粒,以質粒做模板PCR驗證,或著進行酶切驗證;

      (3) 重組失?。褐挥锌召|粒的條帶,說明重組不成功,載體線性化不完全,建議優化酶切體系。

      Q8:菌種(表達用)保存一段時間后出現表達量下降。

      A8:菌種在保存過程中,可能會出現質粒丟失,拷貝數降低的情況,重新培養時適當增加抗生素的濃度,篩選出含高拷貝數質粒的細菌。

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