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      科學研究試劑

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      • R201.21.1.pdf

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        2021-05-21 13:37:19
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      HiScript II Reverse Transcriptase

      HiScript?IIReverseTranscriptase??具有超強耐熱性和延伸效率的新一代逆轉錄酶?·50℃半衰期超過240min,55℃半衰期可達60min·5min即可合成長達10kb的cDNA,適合快速逆轉錄反應?·更高的雜質耐受度、更高的檢測靈敏度,分子診斷首選逆轉錄酶??極高的熱穩定性更強的雜質耐受度?以1μgHeLa細胞總RNA為模板,用不同的酶進行逆轉錄,同時在體系中加入不同
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      R201-01/02
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      說明書

      HiScript® II Reverse Transcriptase

      具有超強耐熱性和延伸效率的新一代逆轉錄酶

      50℃半衰期超過240 min,55℃半衰期可達60 min

      5 min 即可合成長達10 kb 的cDNA,適合快速逆轉錄反應

      更高的雜質耐受度、更高的檢測靈敏度,分子診斷首選逆轉錄酶

      1.極高的熱穩定性

      2.更強的雜質耐受度

      以1 μg HeLa 細胞總RNA 為模板,用不同的酶進行逆轉錄,同時在體系中加入不同濃度的各種反應抑制物。取1 μl cDNA 為模板,AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix 擴增human B2M基因,比較各種條件下CT 值大小。更小的CT 值代表更高的逆轉錄效率,即更高的雜質耐受度。

      3.更高的檢測靈敏度

      以1 μg-1 pg HeLa 細胞總RNA 為模板,用HiScript® II Reverse Transcriptase (R201) 做逆轉錄,取1 μl cDNA為模板,用AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix分別擴增B2M基因(A)和EGFR 基因(B)。

      通過專利的體外分子進化技術,在HiScript® Reverse Transcriptase的基礎上,獲得的一個全新的逆轉錄酶突變體HiScript® II ReverseTranscriptase,其熱穩定性大幅提高。HiScript® II ReverseTranscriptase 在50℃的半衰期超過240 min,并可在55℃長時間反應而保持穩定,提高了具有復雜二級結構模板的逆轉錄成功率,可獲得長至20 kb 的cDNA。同時,高溫下保持的高活性能夠帶來更高的cDNA 產量。

      組分

      R201-01 (2000 U)

      R201-01 (10000 U)

      5×HiScript® II Buffer

      500 μl

      500 μl

      HiScript® II Reverse Transcriptase (200 U/μl)

      10 μl

      50 μl

      -30 ~ -15℃保存。

      關鍵詞:
      R201-01/02
      具有超強耐熱性和延伸效率的新一代逆轉錄酶
      未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

      Q1:原核生物RNA能用我們的逆轉錄試劑嗎?

      A1:可以。原核生物RNA沒有polyA尾,所以在逆轉錄反應體系中需要以Random primer作為逆轉錄引物。

      Q2:逆轉錄試劑盒中帶有gDNA wiper Mix,可以去除殘留在RNA中的基因組。最多可以去除多少的基因組?但如果不進行基因組去除,會影響接下來的逆轉錄嗎?

      A2:我們做過100ng基因組的測試,去除效率是99.95%。如果不進行基因組去除不會影響逆轉錄實驗的進行,但是如果基因組殘留嚴重但不去除的話,會影響接下來定量實驗的準確性。

      Q3:延長逆轉錄時間,是否可以提高逆轉錄效率?

      A3:對于大多數基因,延長逆轉錄時間對逆轉錄效率并沒有顯著提升;對于一些GC含量較高或含高級結構的模板,延長逆轉錄時間可提升逆轉錄效率。

      Q4:做了No RT Control發現有gDNA殘留怎么辦?

      A4:如果使用試劑盒中的gDNA wiper模塊進行gDNA去除,但No RT Control仍有CT值,可通過實驗組和No RT Control組的CT值來判斷實驗數據是否可用。當實驗組CT值與No RT Control對照組CT值差值大于5,說明由gDNA導致的誤差小于5%,則可以忽略gDNA污染;若實驗組與對照組CT值差值小于3或者幾乎一致,則實驗組擴增產物的模板很大一部分來源于gDNA,這樣的實驗組就失去定量意義。

      Q5:如何評判RNA質量?

      A5:RNA質量從兩個方面反應:

      (1) RNA完整度。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整度。以真核生物為例,完整的總RNA有清晰的三條帶,分子量從大到小分別為28S、18S、5S,并且28S是18S亮度的兩倍;若能看見三條帶,但帶型模糊或彌散,則說明RNA有部分降解,此時請立即進行逆轉錄反應,并適量加大模板量;若只能看見分子量很小的一條帶或沒有條帶,則 RNA 已完全降解,需要重新提取。

      (2) RNA的純度。RNA的純度可以通過OD260/280和OD260/230兩個比值是否在1.8-2.1范圍內進行判斷,蛋白、離子等殘留會使比值降低。

      Q6:如何選擇逆轉錄的引物?

      A6:根據實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT或基因特異性引物進行逆轉錄。

      (1) 隨機引物:隨機結合在RNA的任何區域,適用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA類型的逆轉錄反應。

      (2) Oligo dT:適用于具有PolyA尾的RNA(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾)。 由于Oligo dT結合在PolyA尾上,所以對 RNA 樣品的質量要求較高,即使有少量的降解也會使全長cDNA合成量大大減少。

      (3) 基因特異性引物:與模板序列互補,適用于序列已知的基因逆轉錄。

      cDNA后續進行PCR擴增長片段,一般用Oligo dT或者基因特異性引物,不建議使用隨機引物,因為隨機引物是隨機結合的,cDNA片段會偏短,可能會對長片段擴增造成稀釋,后續擴增不出全長的目的基因;cDNA后續進行qPCR,一般使用Oligo dT和隨機引物的混合物,可以避免3’端和5’端的擴增偏好性。

      Q7:可以通過測逆轉產物cDNA濃度判定逆轉效率嗎?

      A7:不可以,逆轉錄產物cDNA是混合物,除了cDNA產物以外,還有buffer、逆轉錄酶、引物,同時還包含未轉錄的模板RNA,總RNA中的tRNA、rRNA等,都會干擾濃度測定結果,因此不能反應真實的cDNA產量。

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